ДЕЩО ПРО ВИКОРИСТАННЯ ПЛР У РИБОГОСПОДАРСЬКИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ

Риби Азово-Чорноморського басейну демонструють дивовижне різноманіття форм. Ідентифікація видів та внутрішньовидових форм представляє інтерес не тільки в аспекті систематики, але й також в аспекті розроблення адекватних заходів з охорони, раціонального використання та відновлення природних популяцій цінних видів риб.

Ідентифікація риб традиційно базується на морфологічних ознаках. Однак через велику різноманітність та морфологічну пластичність лише морфологічних ознак виявляється недостатньо для визначення внутрішньопопуляційних угруповань.

Сучасні розробки у сфері молекулярних методів революціонізували процес вивчення складу іхтіофауни природних водойм. Як один з найдоступніших з цих методів можна назвати метод ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції), який приніс з собою великі переваги. ПЛР - це відмінна методика для швидкого виявлення генетичних ознак риб, і, поряд із звичайними методами аналізу, ПЛР відіграє все більшу роль в науково-дослідницькій діяльності ІРЕМ стосовно риб Азово-Чорноморського басейну.

Полімеразну ланцюгову реакцію винайшов у 1983 році Кері Мулліс (американський вчений). Згодом він отримав за цей винахід Нобелівську премію.

ПЛР - експериментальний метод молекулярної біології, що дозволяє значне збільшення малих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) в біологічному матеріалі (пробі).

В основі методу ПЛР - фіксація та багатократне подвоєння певної ділянки ДНК за допомогою ферментів у штучних умовах (in vitro). В результаті відбувається акумуляція ДНК у кількості, достатній для візуальної детекції. При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки у тому випадку, якщо це властиво біологічному матеріалу досліджуваного зразку.

Отже, ПЛР - це багаторазове копіювання певних фрагментів ДНК у процесі повторюваних температурних циклів. Як же ж протікає процес реакції в межах одного температурного циклу?

Синтез нуклеотидного ланцюга здійснюється ферментом - ДНК-полімеразою. Однак для початку роботи ферменту є необхідний стартовий майданчик. У цієї ролі виступають "праймери" - синтетичні олігонуклеотиди довжиною 15-20 нуклеотидів. Кількість праймерів залежить від обраного метода аналізу, проте, незалежно від їх кількості, праймери є комплементарними ділянкам ДНК-матриці, і саме фрагмент ДНК, обмежений праймерами, буде багаторазово копіюватись ДНК-полімеразою. Робота полімерази полягає у послідовному додаванні нуклеотидів, комплементарних послідовності ДНК-матриці. Тим самим в одному температурному циклі знову синтезуються два нових фрагменти ДНК (оскільки молекула ДНК - дволанцюгова, то і матриць спочатку є дві). Таким чином, за 25-35 циклів у пробірці накопичуються мільярди копій ділянки ДНК, визначеної праймерами.

Лабораторія генетичних досліджень ІРЕМ вже на протязі багатьох років здійснює дослідження на основі ПЛР-методу.

Зусиллями наших фахівців зібрано велику колекцію генетичних матеріалів риб, що мешкають як у водних об'єктах України, так і у деяких районах Світового океану.

Завдяки використанню ПЛР-методу ІРЕМ здійснює генетичну експертизу видової належності осетрових риб та продукції з них (що є необхідним для виконання міжнародних зобов'язань України за конвенцією CITES).

Генетичний аналіз поліморфізму зібраних зразків морської фауни дозволяє виявити внутрішньопопуляційні угруповання та визначити морські райони, що потребують посиленого нагляду з метою поліпшення стану іхтіофауни, зокрема шляхом впровадження заходів для збереження важливих ділянок природної репродукції.

Треба зазначити, що генетичні дослідження, зважуючи на їх технологічну складність та ресурсоємність, вимагають окремої уваги з боку держави в аспекті підтримки цього виду наукової діяльності.

Маємо надію на гарні перспективи та розвиток вітчизняної рибогосподарської генетики, разом із загальним розвитком економіки України.

Реакції ПЛР передує процес виділення ДНК із зразку

---

Ампліфікація зразка

---

У подальшому, після ПЛР, накопичені фрагменти ДНК розділяються за допомогою гель-електрофорезу

---

Після закінчення процедури електрофорезу, гель забарвлюється,та отриманий результат аналізується за допомогою відповідного програмного забезпечення: на даному малюнку зображено результат аналізу ПЛР-RAPD аналізу азовського та чорноморського калкану

---